三株新城疫广西分离野毒株全基因序列的测定与
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  新城疫(Newcastle Disease ,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种烈性传染病,它的发生常常给养禽业造成巨大的经济损失[1]。新城疫病毒为副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)的成员之一,为单股不分节段的负链RNA病毒[2]。其基因组长度约为15kb,包含6个基因:3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,分别编码6个主要蛋白质(NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白)[3],目前,genebank 上已发表的NDV全基因序列共有两种长度:其中ZJ1(AF431744)、U.S/Largo/71(AY562900)、Italy/2736/00(AY562989)等7个毒株的全基因序列长度为15192bp;其它毒株如B1、LaSota、Clone-30等为15186bp。近年来,随着NDV毒株B1、LaSota、Clone-30、Beaudette C 以及ZJ1等全基因序列先后被测定,使人们在分子生物学领域对NDV的研究取得了较大的进展,为运用反向遗传技术研究NDV分子生物学特性提供了依据,也为基因疫苗的研制奠定了基础。
本实验室于2002、2003年分别从广西不同地区的大型规模化养鸡场分离到3株NDV病毒GX7/02、GX9/03和GX11/03,经致病性测定以及对F基因的克隆测序,证明为强毒株[4,5]。通过对F基因和HN基因的序列分析,发现其抗原位点发生了一定的改变[5,6]。为了进一步研究这3株新城疫病毒的生物学特性,从分子水平上揭示其生物学背景,我们以GenBank上发表的NDV全基因序列为依据,以ZJ1等毒株为主要参考,设计了8对引物,采用RT-PCR方法扩增出其完整基因,并将所得的全基因序列与GenBank上发表的全基因序列进行了比较和分析,现将结果报告如下:
1材料和方法
1.1 病毒
实验所用毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03由笔者所在实验室分离鉴定和保存。通过MDT、ICPI、ELD50实验以及F基因和HN基因的克隆、测序及分析证明为强毒株[4,5,6]。
1.2 主要试剂
RT-PCR试剂盒、PMD18-T载体、凝胶回收试剂盒购自Takara公司;LB培养基、Trizol抽提试剂购自GIBCOL公司;氨苄青霉素、χ-gal、IPTG为PROMEGA公司产品。
1.3 病毒RNA的提取
按Xie等[7]方法,取感染鸡胚尿囊液用Trizol抽提试剂进行RNA的抽提。
1.4 NDV 各基因组的扩增及克隆
1.4.1 引物的设计与合成
 

  参考GeneBank已公布的NDV全基因序列,以鹅源新城疫病毒ZJ1(AF431744)毒株的核苷酸序列为主要参考,共设计了8对引物,相邻扩增片段之间,有部分核酸序列重叠,引物覆盖整个NDV基因组,由大连宝生物工程有限公司合成,引物序列在表1中列出。

   1.4.2 NDV 各基因的cDNA合成
采用20μl的cDNA合成体系置于0.2 ml反应管中,取溶于DEPC水中的NDV RNA 样品 5 μl,分别加入随机引物(Random 9 mers) 1 μl,10倍 RT-PCR 缓冲液2 μl,dNTPs(10 mM) 2 μl, RNA酶抑制剂 1 μl,AMV 反转录酶 1μl,用无RNase的超纯水加至总体积为 20 μl,置于PCR仪中进行cDNA合成,以25℃ 10 min,42 ℃ 60 min,99℃ 5min,4 ℃ 5min的程序进行一个循环,结束cDNA合成后,进入PCR扩增。
1.4.3 NDV 各基因的扩增
PCR反应体系100μl:在PCR反应管中分别加入cDNA 4μl,上、下游引物各 1μl (100 pmol/μl),5× PCR Buffer 10μl,dNTPs(10 mM)2 μl, Taq DNA聚合酶 0.5μl(5 U/μl),灭菌超纯水加至100 μl,置于PCR仪中进行PCR扩增。首先95 ℃预变性5 min,然后进行以94 ℃ 60 s,55℃ 45 s(F基因为1min),72 ℃ 90 s的PCR循环,进行35个循环后于72 ℃延伸10 min,4 ℃结束反应。取PCR产物10 μl,用1% 琼脂糖凝胶电泳观察分析PCR产物。
1.5 各基因PCR产物的纯化
取PCR产物适量于12 g/L琼脂凝糖胶上电泳,于紫外线仪上用刀片切割收集所需的片段,然后按凝胶回收试剂盒操作说明纯化回收PCR产物。
1.6 纯化PCR产物与T载体的连接及转化
取适量经纯化回收的PCR产物按说明加入连接体系,于16 ℃连接过夜,取连接产物转化DH5α大肠杆菌。
1.7 阳性重组质粒的筛选和鉴定
挑取在含氨苄青霉素的LB培养基上长出的白色菌落,少量培养,用碱裂解法抽提质粒进行PCR快速鉴定。
1.8 重组质粒的核苷酸序列测定
将阳性克隆菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序。
1.9 用上述材料和方法对2000年至2004年本实验室从广西不同地区所分离的其它8株新城疫病毒的NP基因进行克隆和测序。
2结果及分析
2.1 运用8对引物分别扩增出的NP、P、M、F、HN、L基因片段与设计相符,将测序所得结果用生物软件进行拼接,所得GX7/02、GX9/03和GX11/03三个NDV毒株的全基因序列长度均为15192bp。与GeneBank上所公布的ZJ1(AF431744)、U.S/Largo/71(AY562900)、U.S(ca)/1083(Fontana)/72(AY562988) 、Italy/2736/00(AY562989)、 U.S(ca)/211472/02(AY562987)、 U.S(F1)/44083/93(AY562986)、Indonesia/14698/90(AY562985)7株NDV的全基因长度相同。
2.2 NDV广西分离株GX7/02、GX9/03和GX11/03比GenBank上公布的LaSota、B1和Clone-30等 NDV毒株的全基因序列(15186bp)长6nt,多出的6个核苷酸都位于基因组的NP基因内,相对于LaSota、B1、Clone-30毒株全基因组的1647nt-1648nt位。将全基因序列长度为15192bp的毒株进行序列比较,发现国内毒株GX7/02、GX9/03、GX11/03和ZJ1所多出的6个碱基位置和组成都相同,都为T-C-C-C-A-C。而6个国外毒株相对于LaSota、B1、Clone-30所多出的6个碱基无论在位置上还是组成上都缺乏统一性,毒株U.S/Largo/71和U.S(ca)/211472/02所多出的碱基位于1647nt-1648nt ,Italy/2736/00、 U.S(ca)/1083(Fontana)/72所多出的碱基位于1646nt-1647nt,Indonesia/14698/90则位于1645nt-1646nt ,U.S(F1)/44083/93位于1644nt-1645nt,所多出的6个碱基在组成上只有U.S/Largo/71和U.S(ca)/211472/02相同,在其它毒株中缺乏统一性。(结果见表2)
 


 

  2.3 将GX7/02、GX9/03和GX11/03的全基因序列与国内外NDV参考毒株进行比较分析,发现此三个毒株与弱毒疫苗株LaSota、Clone-30、B1 以及强毒株 Beaudette C各基因编码区的核苷酸和氨基酸的同源性较低,而与序列长度为15192bp的国内分离株ZJ1的同源性较高,与U.S/Largo/71和 Indonesia/14698/90等6个毒株的同源性相对较低。将GX7/02、GX9/03和GX11/03三个毒株的各个基因的编码区序列进行比较,结果显示此三株病毒的同源性非常高,各个基因编码区的核苷酸和氨基酸同源性分别在94.2%~99.6%和95.8%~99.2%之间。NDV各毒株间的核苷酸及其推导的氨基酸序列的同源性比较结果见表3。
 

  

   Comp 3=comparing GX7/02、GX9/03 and GX11/03 with ZJ1 NDV strain reciprocally
Comp 4= comparing 3 NDV strains(GX7/02、GX9/03 and GX11/03) reciprocally
Comp 5= comparing GX7/02、GX9/03 and GX11/03 with other 6 NDV strains(U.S/Largo/71、U.S(ca)/1083(Fontana)/72、U.S(ca)/211472/02、U.S(F1)/44083/93、Indonesia/14698/90) respectively
n= nucleotide homology a= amino acid homology
2.4 将全基因长度为15192bp的10个毒株的氨基酸序列进行比较,发现它们F基因裂解位点的氨基酸序列都为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV强毒株F基因裂解位点的氨基酸特征序列112-R-R-Q-K/R-R-F117相符合[17,18,19,20],说明他们都为强毒株。将NDV毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03的F基因编码区序列与其它7株全基因长度为15192bp的毒株,以及F48E9(国内标准强毒株)、HB92(国内弱毒株)、Herts33(英国标准强毒株)、弱毒疫苗株B1、LaSota、Clone-30的相应序列进行遗传进化分析,遗传进化树见图4。发现GX7/02、GX9/03和GX11/03毒株与ZJ1毒株亲缘关系较近,而与F48E9、HB92、Herts33 、B1、LaSota、Clone-30毒株的亲缘关系较远。同时可以看出,GX7/02、GX9/03和GX11/03毒株与序列长度为15192bp的国外毒株位于同一分支上,亲缘关系相对较近。
 


 

   2.5 将新城疫毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03全基因组阅读框架及编码区与其它毒株进行比较,发现GX7/02、GX9/03和GX11/03三个毒株的基因组所编码的蛋白与其它毒株相似(见表4)。此外,此3株病毒各基因的起始、终止及基因间隔区序列与其它NDV毒株的相应序列具有高度的同源性,NP-P、P-M、M-F、F-HN、HN-L各基因间区的序列长度依次为1nt、1nt、1nt、31nt和32nt,长度符合NDV基因组各基因之间的间隔区序列长度范围1nt-47nt。
 


 

   2.6 对2000年至2004年本实验室从广西不同地区所分离的其它8株新城疫病毒的NP基因进行克隆和测序,结果显示,此8株新城疫病毒的NP基因同样多出6个核苷酸,此6个核苷酸的组成和位置均均与GX7/02、GX9/03和GX11/03相同。
3讨 论
新城疫病毒广西分离株GX7/02、GX9/03和GX11/03的全基因序列均为15192bp,与Genebank上所公布的ZJ1(AF431744)、U.S/Largo/71(AY562900)、Italy/2736/00 (AY562989)等7株NDV的全基因长度相同。而比GenBank上公布的LaSota、B1和Clone-30等 NDV毒株的全基因序列(15186bp)长6nt。所多出的碱基位于NP基因内。目前,公布的NDV全基因组长度有两种,即:15186bp和15192bp,这两种长度都符合六规则(the rule of six),即对于某些副粘病毒来说,只有它们的RNA核苷酸长度是6的倍数,其RNA复制才是高效的[8],此规律特别适用于那些具有RNA编辑位点的副粘病毒[9],已经证实它对于SeV[8]、MeV[10]和PIV3[11]是有意义的,而对于RSV[12]却无效。六规则 最初来源于对Sendai Virus(仙台病毒)NP基因的研究,结果显示只有其NP基因的核苷酸序列是6的倍数时才能高效复制[8] 。而目前所测得的NDV毒株全基因序列中,NP基因共有两种长度,即1464和1470,都为6的倍数,即也符合原始的六规则。从ZJ1毒株的全基因序列被测定后,基因组长度为15192bp毒株的全基因序列相继被测出,是否还有其它长度基因组的NDV毒株存在,有待于进一步研究,但以六规则(the rule of six)为依据,可以预言,具有新长度基因组的NDV毒株如果存在,其全基因长度也都为6的倍数。
将全基因长度为15192bp的10个毒株(GX7/02、GX9/03、GX11/03、ZJ1、U.S/Largo/71、Italy/2736/00、U.S(ca)/1083(Fontana)/72、U.S(ca)/211472/02、U.S(F1)/44083/93、Indonesia/14698/90)的氨基酸序列进行比较,发现它们F基因裂解位点的氨基酸序列都为112R-R-Q-K-R-F117,说明他们都为强毒株。此外,对本实验室所分离的另外8株新城疫病毒进行NP基因测序,结果表明它们的NP基因内也多出6个碱基,且此8个毒株已被证实为强毒株[4]。那么是否NP基因多出6个核苷酸的毒株一定为强毒株,这一结论需要进一步证实。通过对全基因序列长度为15192的毒株进行序列比较可以看出,对于各个毒株所多出的6个碱基,国内毒株GX7/02、GX9/03、GX11/03和ZJ1在位置和组成上都相同,而国外毒株只有U.S/Largo/71和U.S(ca)/211472/02相同,其它毒株呈现多样性。而且这6个国外的毒株的分离宿主不尽相同,U.S/Largo/71来自观赏鸟[21]、Italy/2736/00、U.S(ca)/1083(Fontana)/72、U.S(ca)/211472/02、U.S(F1)/44083/93、Indonesia/14698/90分别来自鸽子、鸡、猎禽、美洲鸵鸟、美冠鹦鹉[22],因此,所多出的6个碱基是否与毒株的特性相关联,需进一步研究。
NDV毒株GX7/02、GX9/03和GX11的基因组在长度上虽然多出了6个核苷酸,但此6个核苷酸位于NP基因的非编码区内,并不参与NP蛋白的编码,因此对NP蛋白的表达影响不大。但此6个核苷酸是否会在蛋白质的翻译和调控过程中起作用,还不十分清楚。NP基因在正粘病毒中决定着宿主的特异性[16].那么它在副粘病毒中是否扮演着同样的角色?从同源性比较可以看出,我们所测得的鸡源性NDV毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03与鹅源性毒株ZJ1的NP基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.5%~98.2%和97.6%~98.8%,同源性非常高,同时国外毒株U.S/Largo/71和U.S(ca)/211472/02的NP基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%和97.1%,而前者是从观赏鸟(pet birds)体内分离[21],后者是从猎禽(game fowl)体内分离[22]。这说明NP基因在副粘病毒中并不对宿主的特异性起决定性作用。
从核苷酸和氨基酸同源性(表3)以及遗传进化树(图4)可以看出,NDV毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03与ZJ1株的同源性很高,而与NDV疫苗株LaSota、Clone-30、B1 以及强毒株 Beaudette C的同源性较低。这说明新城疫病毒是在不断的进行演化的[15].ZJ1毒株为我国2000年的华东(浙江)分离株,且为鹅源性新城疫病毒[14],而GX7/02、GX9/03和GX11/03为我国2002年和2003年的华南(广西)分离株,为鸡源性新城疫病毒,且此4株病毒都为强毒株。GX7/02、GX9/03和GX11/03属于基因Ⅶ型的Ⅶd亚型[5],与ZJ1毒株属于同一个基因型[13],这说明基因Ⅶ型的NDV其宿主范围广,毒力较强。同时也表明新城疫病毒在演化的过程中,不仅其毒力和基因组结构在发生变化,其宿主范围也在不断的变化,且此变化不受地域的影响。
NDV毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03是分别于2002年和2003年从广西不同地区的大型规模化养鸡场所分离,病鸡发病前都经过正常免疫。根据NDV分离株之间的遗传进化树、酶切位点分析和基因分型的结果,确定GX7/02、GX9/03和GX11/03毒株在基因型分类上属于基因Ⅶ型[5]。而目前我国在NDV疫苗的制作中使用的毒株为B1和LaSota,它们属于经典的基因Ⅱ型。疫苗株与野毒株在基因型上的较大差异是否是造成免疫保护率低的因素,有待于进一步证实。
新城疫国内毒株ZJ1以及GX7/02、GX9/03和GX11/03 的全基因序列先后被测定,这为揭示我国新城疫病毒的现状以及对其进行分子水平上的流行病学调查提供了可靠的依据,为新城疫病毒的反遗传体系的研究提供了较大的帮助,同时也为新型疫苗的研制与开发奠定了基础。
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